簡介
串聯(lián)親和純化技術(shù)法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù),用于在接近細胞真實生理狀態(tài)的條件下純化細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合體。
材料與儀器
器材:SDS- PAGE 電泳裝置、離心機、EP 管、水浴鍋。
試劑:
① IgG Sepharose 6 Fast Flow matrix
② AcTEV protease
③ Calmodulin Affinity Resin
④ NP-40 緩沖液
⑤ IPP150 緩沖液
⑥ TEVCB 緩沖液
⑦ CBB buffer(0.1% 和 0.02%)
⑧ CEB buffer
步驟
串聯(lián)親和純化技術(shù)法的基本過程可分為如下幾步:
(一)細胞裂解及蛋白樣品的制備
A. 懸浮細胞:1400 r/min,4℃ 離心 5 分鐘,用預(yù)冷的 PBS 洗 3 次,按 1ml/107 個細胞加入 NP-40 裂解液,冰箱內(nèi)垂直搖床裂解 60 分鐘,12000 r/min,4℃ 離心 20 分鐘,回收上清,即為細胞的蛋白裂解液。
B. 貼壁細胞:用預(yù)冷的 PBS 洗 3 次,加入 NP-40 裂解液 1ml(90 mm 培養(yǎng)皿),冰上放置 10-60 分鐘,吹打細胞并移入 15 ml 離心管中,12 000r/min4℃ 離心 20 分鐘回收上清,即為細胞的蛋白溶解液。細胞裂解液短期可 4℃ 保存或-80℃ 長期保存。
(二)IgG 親和層析
A. 取 500μl IgG-瓊脂糖微珠和 NP-40 裂解液 1:1(V/V)混合,加入上一步得到的上清中,4℃ 搖床孵育 3 小時。
B. 4℃,1200r/min 離心 2 分鐘,緩慢除去上清,注意不要觸及底部沉淀。
C. 用預(yù)冷的 IPP150 緩沖液洗沉淀 3 次,每次 10 ml。
(三)TEV 酶切
A. 將上一步得到的沉淀轉(zhuǎn)移至 1.5 ml 離心管中,用預(yù)冷 TEVCB 緩沖液洗滌三遍,每次 1 ml。
B. 加入含有 20 個單位 AcTEV 蛋白酶的 TEVCB 緩沖液 1 ml,室溫反應(yīng) 2 小時或 4℃ 搖床過夜。
C. 12000r/min 離心 1 分鐘,收集上清(約 1 ml),轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管中。
(四)鈣調(diào)蛋白親和純化
A. 將 6ml 0.1%CBB 緩沖液加入上一步得到的 IgG 純化洗脫液中。
B. 取 250μl 的鈣調(diào)蛋白親和微珠,用 1ml 0.1%CBB 緩沖液洗滌 3 遍。
C. 微珠與 0.1%CBB 緩沖液 1:1(V/V)混合,加入到 IgG 純化洗脫液中,4℃ 搖床孵育 3 小時。
D. 1200r/min 離心 2 分鐘,10ml 0.02%CBB 緩沖液洗沉淀 3 次。
(五)EGTA 洗脫
A. 將上一步得到的鈣調(diào)蛋白微珠沉淀轉(zhuǎn)移至 1.5ml 離心管,加入 100-200μl 的 CEB 緩沖液,4℃ 搖床孵育 2 小時。
B. 1200r/min 離心 2 分,收集上清,用于 SDS-PAGE 或免疫印跡分析。
(六)蛋白質(zhì)電泳分離(SDS-PAGE)
A. 安裝電泳裝置和玻璃板。
B. 配制分離膠:按照所需濃度和體積依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5mol/L Tris(pH8.8),10%SDS,10% 過硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。
C. 迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液,留出沉積膠所需體積和梳子齒長高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H20,垂直放置于室溫中,約 30 分鐘使膠凝聚。
D. 倒出分離膠上方覆蓋液體,盡量吸干。
E. 配制 5% 濃縮膠,依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5mol/L Tris(pH8.8),10%SDS,10% 過硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。
F. 在分離膠上方灌入濃縮膠,并插入梳子,避免氣泡!再灌入適量濃縮膠填滿梳子齒間縫隙,垂直放置于室溫。
G. 將蛋白樣品加入等量 2 x SDS 加樣緩沖液,100℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000r/min,常溫離心 3 分鐘。
H. 取出濃縮膠中梳子,以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中,在上、下槽均加滿 Tris-Glysine 電泳緩沖液。
L. 加樣 10-20μl。
I. 將電泳裝置通電,電壓 8V/cm,當(dāng)染料前沿進入分離膠后,電壓提高到 15V/cm,電泳至溴酚藍到達膠底部,約 2-4 小時。
J. 關(guān)閉電源,取出玻璃板,撬開玻璃板,小心取出凝膠。
7. 考馬斯亮藍染色或銀染。
8. 質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成。
注意事項
1.實驗設(shè)計 在開始 TAP 實驗前,需要考慮以下幾點:
① 確認靶蛋白中不存在 TEV 酶的識別位點:EXXYXQ(G/S);
② 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),確定 TAP 標簽位于靶蛋白的 N 端還是 C 端,以不影響靶蛋白的正常折疊和功能為準則;
③ 靶蛋白的表達量:通常不推薦使用過表達來進行 TAP 純化,這會影響細胞的生理環(huán)境,提高實驗假陽性,因此使用內(nèi)源性啟動子較為合適;
④ 選擇適合的 TAP 標簽:最初的 TAP 標簽由 Protein A 和鈣調(diào)蛋白組成,但此標簽分子量較大,可能會影響靶蛋白的折疊;現(xiàn)已有由 Protein A 和 Flag 等組成的 TAP 標簽,在保持高親和力的同時減少對靶蛋白的干擾,可以從優(yōu)選擇;
⑤ 對照:比較好的對照是含有 TAP 標簽但不含有靶蛋白的細胞株,提高實驗特異性。
2.由于整個實驗過程較長、步驟較多,建議在每步洗脫時留取少量洗脫液,在實驗結(jié)果不理想時可以幫助發(fā)現(xiàn)和解決潛在的問題。
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